MANUAL

○サンプル調製

ホルマリン保存用とLysis Buffer調製用の胚を山形県内水面水産試験場（米沢市泉町）から採取する。 採取した胚はその日内に処理する。

☆ホルマリン保存

ホルマリンは以下の組成で調製する。

ホルマリン保存は、一本のサンプルチューブに胚を４粒入れ、ホルマリンを適当量注入する。

☆Lysis buffer調整

Lysis buffer調製は、以下の組成で調製する｡

※注：Lysis Bufferの分量はサンプル（胚）の量により適宜調整する。

1. サンプルチューブに、それぞれサンプル(胚１粒)とLysis buffer 1mlを加える。
2. メスで卵殻に穴をあける。
3. サンプルチューブを氷水につけながら超音波処理を行う。
4. 10,000Ｇで一分間遠心分離する。
5. 直ちに電気泳動しない場合は−30℃以下で冷凍保存しておく。

○一次元電気泳動法

＜１Ｄゲルの膨潤＞

1. Ｕフレーム（0.5ｍｍ）付きガラスプレートのフレームがついている側にリペルシランを塗布し乾燥させる。
2. Immobline Dry Strip（１Ｄゲル）をとりだす。（サポートフィルムと保護フィルムにはさまった形になっている）
3. １Dゲルの保護フィルムをとる。
4. Ｕフレーム付いていないガラスプレートに蒸留水を１〜２滴落とし、１Ｄゲルのサポートフィルムを下にして気泡をかまないように密着させる。
5. キムワイプで余分な水分を吸い取る。
6. Ｕフレーム付ガラスプレートの端にある穴にチューブをさしクリップをつける。
7. ゲルをのせたガラスプレートにＵフレーム付ガラスプレートを重ね、周りを（Ｕフレームのゴムの部分に合わせて）クランプで止める。
8. 膨潤カセットにつけたチューブからシリンジを用いて膨潤液をゆっくりと注入する。
9. １Dゲルが十分つかるほど膨潤液を満たしたらクリップを閉める。
10. 膨張時間は最低６時間、室温で行う。（冷やすとUreaが析出する）

＜一次元目（等電点）電気泳動＞

☆泳動装置の設定

1. LKB 2219 MultiTemp II Thermostatic Circular（冷却板）の電源を入れ冷却版を10℃に冷却する。
2. 冷却版にケロシンを5〜6ｍｌ塗布し、トレイをセットする。
3. シリコンオイルをトレイに8〜9ｍｌ注ぎ、薬サジ等を使ってトレイ内に広げる。
4. アライナーの裏側にシリコンオイルを2〜3ｍｌ広げる。
5. 手袋を装着し、アライナーをトレイに置く。この時、間に気泡が入らないように注意する。
6. アライナーを押さえて余分なオイルと気泡をとる。
7. アライナーの上のシリコンオイルを拭き取る。
8. シリコンオイルを１Ｄゲルを置く所（溝の部分）に薄く塗る。
9. 膨潤カセットを開け１Ｄゲルをガラスプレート上のサポートフィルム側を下にしておく。
10. ゲル表面に直接キムワイプを置いて上から軽くおし、余分な液を除く。
11. １Ｄゲルをアライナーの谷間の部分に置く。
12. ＩＥＦ electrode strip（以後ＩＥＦに略）を10ｃｍ長に２本カットする。
13. カットしたＩＥＦに蒸留水を500μｌ染み込ませる。
14. キムワイプで余分な水を拭き取る。
15. ＩＥＦをゲルに3ｍｍほどかかるように、ゲルの両端に置く。
16. ＩＥＦ上に電極をセットする。（電極線がＩＥＦ上に乗っている事を確認）
17. サンプルカップバーにサンプルカップを軽くはめ込む。
18. サンプルカップバーを電極間の任意の位置に置く。
19. サンプルカップをスライドさせて、カップをゲルの位置に合わせる。
20. サンプルカップを押し曲げてゲルに密着させる。
21. シリコンオイル70〜80ｍｌをトレイに注ぐ。（サンプルカップ内に入らないように注意する）
22. サンプルカップ内にシリコンオイルが漏れていない事を確認。
23. 漏れがあった場合は再度サンプルカップをゲルに密着させる。カップ内のオイルはキムワイプで拭き取る。
24. 漏れが無ければサンプルカップ内をシリコンオイルで満たす。
25. サンプルカップ内にサンプルをアプライする。

･ サンプルカップには100μｌまでアプライ可能。

･ サンプル水溶液はシリコンオイルよりも重いのでカップの底に沈む。

26. トレイの電源をそれぞれ差し込む。
27. リッド（蓋）を閉める。
28. Multi Drive XL power supply (電源)のスイッチを入れESCキーを何度か押し初期画面に戻す。
29. PROGRAMを選択し、RUNを選択する。
30. １Ｄゲルの長さに応じてMethodを選択（11cmゲルは"1", 18cmゲルは"3"）を選択した後、電源を入れ（赤いボタンを押す）泳動を開始する。
31. mAの値を見て通電しているか（値が０ではないか）を確認する。
32. 泳動終了後（11cmゲルは16時間後、18cmゲルは20.5時間後）直ちに１Ｄゲルを試験管に入れ-30℃で保存する。

※一次元目電気泳動における注意事項

• 泳動が終わったら直ぐに１Ｄゲルを冷凍保存(-30℃)しておくこと。長い間放置するとタンパク質が拡散し、泳動図がぼやける。
• 22の操作でカップから少しでも漏れがあるとサンプルが漏れて泳動が上手くいかなくなる。カップの漏れ確認はきちんと行なうこと。

☆　Multi Drive XL power supply　（電源）の初期設定

☆　Multi Drive XL における泳動条件

（１Dゲル110mmのとき ; Method 1）

（１Dゲル180mmのとき ; Method 3）

Immobline Dry Strip Kitの洗浄法

1. 泳動終了後Immobline Dry Strip Kitは直ちに洗浄する。
2. シリコンオイルの付いた器具は、30〜40℃のお湯で、中性洗剤で洗浄する。
3. 湯の温度が高すぎるとアライナーが歪んでしまうので注意する。
4. スポンジはシリコンオイルを吸収してしまい、他の器具を汚す恐れがあるので、専用に用いる。
5. 洗浄後、蒸留水でリンスし乾燥する。

〇二次元目電気泳動法

＜ＳＤＳ平衡化バッファー＞

ＳＤＳ平衡化バッファーの調製

（ａ）ストック溶液

（ｂ）SDS平衡化バッファー

（ｃ）SDS平衡化バッファーＡ

（ｄ）ＳＤＳ平衡化バッファーＢ

☆ＳＤＳ平衡化手順

1. 一次元目電気泳動終了後、リット、電極、サンプルカップバー、ＩＥＦの順に外し、シリコンオイルはシリンジを用いて他の容器に移す。
2. ピンセットでゲルを取り出し、サポートフィルムについているシリコンオイルをキムワイプで拭き取る。
3. サポートフィルムを管壁側にし１Ｄゲルを試験管に入れる。（すぐに平衡化しない場合は−30℃で冷凍保存）
4. ＳＤＳ平衡化バッファーＡ 10μlを１Ｄゲルの入った試験管に入れキャップを閉めて10分間ゆっくり揺らしながら浸透させる。
5. ＳＤＳ平衡化バッファーＡを捨て（廃液用タンク）、ＳＤＳ平衡化バッファーＢ 10μlも同様に10分間浸透させる。
6. 湿らせたろ紙に１Ｄゲルを横に立てて3〜20分間放置する。

＜二次元目電気泳動＞

☆泳動装置の設定

1. 泳動槽の電源を入れ冷却版を10℃に冷却する。
2. トレイを外し冷却版を拭きケロシンを2〜3mlたらす。
3. 手袋を着用しSDS Excel Gel（２Ｄゲル）の袋を開封する。
4. サポートフィルムの角を落としている長辺側を陽極（右）側に置く。
5. ゲル面を上にして２Ｄゲルを冷却板の上に置く。このとき冷却板とサポートフィルムの間に気泡が入らないようにする。
6. キムワイプで余分なケロシンを拭き取る。
7. 手袋を着用しバッファーストリップを開封する。
8. 容器を左右に押し広げバッファーストリップを取り出す。
9. バッファーストリップの狭い方の面を下にして両ゲルの端に置く。透明なバッファーストリップを陰極側に、黄色いバッファーストリップを陽極側に置く。
10. １Ｄゲルの両端のゲルを5mm取り除く。
11. １Ｄゲルの両端のサポートフィルムを1cm切り取る。
12. １Ｄゲルのゲル面を下にして陰極側に置く。
13. １Ｄゲルの端にサンプルアプリケーションピース（ろ紙）を差し込む。
14. 分子量マーカーを一緒に泳動させる時は、空いているスペース（両端ｏｒ中央）にサンプルアプリケーションピースを差し込み、マーカーを染み込ませる。
15. １Ｄゲルをピンセットでおさえ、１Ｄゲルと２Ｄゲルの間にかんでいる気泡を抜く。
16. 電極をセットする。
17. ガラスリッドの足を穴に落とし電極をバッファーストリップと密着する。
18. 電極コードを差し込む。
19. リッドを閉める。
20. Multi Drive XL power supply (電源)のスイッチを入れESCキーを何度か押し初期画面に戻す。
21. PROGRAMを選択し、RUNを選択する。
22. １Ｄゲルの長さに応じてMethodを選択（11cmゲルは"1", 18cmゲルは"3"）を選択した後、電源を入れ（赤いボタンを押す）泳動を開始する。
23. mAの値を見て通電しているか（値が０ではないか）を確認する。
24. 泳動終了後（11cmゲルは16時間後、18cmゲルは20.5時間後）直ちに１Ｄゲルを試験管に入れ-30℃で保存する。

☆二次元目電気泳動の泳動条件

・Exel Gel SDS gradient 8-18（小さいゲル）の場合

・Exel Gel XL SDS 12-14（大きいゲル）の場合

☆二次元目電気泳動中の手順

1. Step１が終了したら、１Ｄゲルとサンプルアプリケーションピースを除去する。
2. Step２が終了したら、陰極側のバッファーストリップを１Ｄゲルの位置まで移動させ泳動を再開する。
3. Step３が終了したかどうかは、青色のライン(BPB)が陽極側のバッファーストリップに到着するまで。

☆注意事項

1. １Ｄゲル、２Ｄゲル、バッファーストリップに触る時は必ず手袋を着用する。
2. バッファーストリップは電極から外れやすいので20分毎に点検する。（バッファーストリップが電極から外れた場合、器具とゲルが焦げる可能性あり）
3. Step１ または Step３ の最中に、銀染色あるいはブロッティングの試薬、使用する器具等を準備しておく。

〇銀染色（二次元泳動地図作成）

☆銀染色手順

1. ２Ｄゲルを浸すバットを蒸留水で洗浄する。
2. 固定液に２Ｄゲルを浸し30分（或いはそれ以上）浸透させる。
3. Incubation Solutionにグルタルアルデヒド1.3ml（ゲル２枚のときは2.6ml）を加え、これに２Ｄゲルを浸して30分浸透させる。
4. 蒸留水（約250ml）で５分×３回洗浄する。
5. silver Solutionにホルムアルデヒド50μl（ゲル２枚のときは100μl）を加え、これに２Ｄゲルを浸して40分浸透させる。
6. 蒸留水（約250ml）で数秒リンスする。
7. 現像液にホルムアルデヒド25μｌ（ゲル２枚のときは50μl）を加え、この液の100mlに２Ｄゲルを浸し、5〜10分ゆっくり揺らしながら浸透させる。
8. 現像液が黒ずんできたら残っている現像液と取り替える。
9. 現像には最低でも合計15分以上費やす。
10. スポットが現れなければホルムアルデヒド10μlを追加する。
11. ある程度スポットが確認できたらStop Soloutionに浸し5〜10分（或いはそれ以上）浸透させる。
12. セロファンシートを上にして保護液に浸し20分浸透させる。
13. ガラスプレートに２Ｄゲルを乗せセロファンシートで包み周りをクランプで止める。
14. クランプのつまみを足にし、立てて放置乾燥する。（約1週間）
15. 乾燥したらガラスプレートから２Ｄゲルを外し裏面の汚れをキムワイプで拭き取る。
16. ２Ｄゲルの縁に沿って余分なセロファンシートをカットする。
17. 日付、サンプル名等を記入したラベルを貼る。

☆試薬調製

1. 固定液

試薬	1枚分	2枚分
エタノール	80ml	160ml
酢酸	20ml	40ml
蒸留水 upto	200ml	400ml



2. Incubation Solution

試薬	1枚分	2枚分
酢酸ナトリウム・３水塩	17g	34g
エタノール	80ml	160ml
チオ硫酸ナトリウム	0.5g	1.0g
グルタルアルデヒド (GA)	1.3ml	2.6ml
蒸留水 upto	250ml	500ml

（注）使用直前にグルタルアルデヒド(GA)を加える。

3. Silver Solution

試薬	1枚分	2枚分
硝酸銀	0.25g	0.50g
ホルムアルデヒド (FA)	50μl	100μl
蒸留水 upto	250ml	500ml

（注）使用直前にホルムアルデヒド(FA)を加える。

4. 現像液

試薬	1枚分	2枚分
炭酸ナトリウム	6.25g	12.5g
ホルムアルデヒド (FA)	25μl	50μl
蒸留水 upto	250ml	500ml

（注）使用直前にホルムアルデヒド(FA)を加える。

5. Stop Solution

試薬	1枚分	2枚分
EDTA-2Na	3.65g	7.30g
蒸留水 upto	250ml	500ml



6. 保護液

試薬	1枚分	2枚分
グリセロール	20ml	40ml
蒸留水 upto	200ml	400ml

〇ブロッティング

二次元目電気泳動が終了したら、２Ｄゲルをゲルリムーバーではがし、以下の操作でＰＶＤＦ膜にタンパク質成分を転写する。

☆ＰＶＤＦ膜の準備

1. メスを切るために使用するメス等の器具は、予め蒸留水で洗浄する。
2. ＰＶＤＦ膜を２Ｄゲルと同じ大きさに切る。(小ゲル：11cm×25cm、大ゲル：19cm×25cm)
3. ブロティングを行なう直前にＰＶＤＦ膜を100％メタノールに数秒つける。（ＰＶＤＦ膜が透明になるまで）
4. １の膜をTowbin buffer ９につける。
   ・溶液中に沈むまでつける。
   ・ＰＶＤＦ膜が乾いたら１からやりなおす。

☆電極ろ紙(Electrode Paper)の準備

２Ｄゲルと同じ大きさの電極ろ紙(小ゲル：11cm×25cm、大ゲル：19cm×25cm)を18枚 (９枚×２)準備する。

☆ゲルの処理

泳動した２Ｄゲル上に電極ろ紙を一枚のせ、Film Removerで２Ｄゲルをサポートフィルムからはがす。

☆装置の組み立て

1. 陰極、陽極のグラファイト面（電極面）を蒸留水でリンスし、キムワイプで拭く。
2. バッファータンクの前方にリード線がくるように、陽極を設置する。
3. 陽極の電極ソケット（赤リード線）をバッファータンク右側の陽極ピンに接続する。（この陽極のグラファイト面に転写ユニットを組立てる。）

★ブロッティング

1. ゲルの大きさに切った電極ろ紙９枚をTowbin buffer ９につけ、電極面の陽極側に置く。
2. 準備したＰＶＤＦ膜を１の電極ろ紙の上に置く。
3. ２Ｄゲル上に１枚の電極ろ紙をのせる。
4. Film Removerでサポートフィルムから２Ｄゲルをはがす。
5. Film Removerではがした２Ｄゲルを、ゲル面を下にしてＰＶＤＦ膜の上に乗せる。
6. ８枚の電極ろ紙をTowbin buffer ９につけ、ゲルの上に乗せる。
7. 電極面の陰極をセットし、陰極の上を押し付け気泡を抜く。
8. 電極コードを差し込む。
9. リッドを閉める。
10. 通電を開始する。このとき電源はElectrophoresis Power Supply EPS 1000（１Ｄ、２Ｄ泳動で使用した電源ではない方の電源）を使用する。

☆通電の方法

• Electrophoresis Power Supply EPS 1000の電源を入れる。
• ２Ｄゲルの大きさに合わせて、上下キーで通電条件を選択する。

ゲル	記号	電流
11cmゲル（小ゲル）	P1	220mA
18cmゲル（大ゲル）	P2	360mA

• runキーを押す。
• mAの値を見て通電しているか(値が0ではないか)確認する。

☆ＣＢＢ染色

ブロッティングが終了したらCoomassie Blue染色を行う。

（１）ＰＶＤＦ membrane stain

（２）ＰＶＤＦ menbrane destain

５０％　メタノール

☆染色法

1. ＰＶＤＦ膜を浸すバットを蒸留水で洗浄する。
2. ブロッティングが終わったら、ＰＶＤＦ膜を取り出し、蒸留水で５分×３回リンスする。
3. ＰＶＤＦ menbrane stainで、５分間染色する。
4. ＰＶＤＦ menbrane destainで、バックグラウンドがライトブルーになるまで溶液を取り替えながら脱色する。
5. ＰＶＤＦ膜を乾燥させ、ＰＶＤＦ膜を−30℃以下で冷凍保存する。