〇シーケンサ（Ｎ末端配列解析）

476A Protein Sequencer マニュアル

☆ 目次

1: 試薬、溶媒の交換手順

2: シーケンサーの保守

3: サンプル解析

4: トラブルシューティング

1 : 試薬、溶媒の交換手順

シーケンサー試薬（Ａ３、Ｂ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４Ａ、Ｓ２Ｂ、Ｓ４Ｂ）はなくなり次第交換する。 但しＲ２Ｂは揮発しやすいので５００サイクルごとに交換する。 また劇物・毒物（Ｂ２、Ｓ２Ｂ、Ｓ４Ｂ）は劇物・毒物の棚に入れておき、使用するごとにチェック簿に記入しておく。 以下にシーケンサー停止中の交換法を示す。

1.1 : ＨＰＬＣ溶媒（Ａ３、Ｂ２）の交換手順

  1. Ａ３の２lビンにPremix Buffer４０ml加える。（Ｂ２はそのままでよい） Ａ、Ｈの分離が悪くなってきたら、さらに１０ml加える。
    Ａ３（3.5% テトラヒドロフラン(THF)／水      ：室温
Ｂ２（アセトニトリル／12% イソプロパノール）：室温・劇物
  2. ４７６Ａのオープンドアを開け、天井部右側にあるパージノブを一回転半程度ゆるめる。
  3. 試薬Ａ３、Ｂ２を交換する。
  4. （コントロールパネル操作）ＭＡＩＮ ＭＡＮＵから以下のキーを順番に押す。 
    ＨＰＬＣ＞キー
ｐｕｍｐ＞キー
ｐｕｒｇｅ＞キー
  5. ディスプレイがＰＵＲＧＥ ＰＵＭＰのページになったら以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
    ＮＵＭＢＥＲ ＯＦ ＰＵＲＧＥ：０ ＯＦ １
ＰＥＲＣＥＮＴ ＯＦ ＳＹＲＩＮＧＥ：  １００
ＰＵＲＧＥ ＲＡＴＥ（μｌ／ｍｉｎ）：  ７０００
  6. 設定後 ｐｕｒｇｅ＞キーを押す。（この時ｐｕｒｇｅ＞キーがｓｔｏｐ＞キーに変わる）
  7. パージが終了したら、パージノブを締める。
  8. フリーランニングを行なう。 
    ｍａｎｕａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ＞キー
ＨＰＬＣ＞キー
ｐｕｍｐ＞キー
ｆｒｅｅｒｕｎ＞キー
  9. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
             μl／Min    ％Ｂ      psi      ％Left
ＳＥＴ｝  ３００     ９０   ３０００      ？
ＮＯＷ｝    ０        ？       ？         ？
  10. ｒｕｎ＞キーを押す。
  11. ５分後 ｓｔｏｐ＞キーで終了し以下のパラメータを設定する。 
             μl／Min    ％Ｂ      psi      ％Left
ＳＥＴ｝  ３００     ９０   ３０００      ？
ＮＯＷ｝    ０        ？       ？         ？
  12. ｒｕｎ＞キーを押す。
  13. ５分後 ｓｔｏｐ＞キーで終了する。

1.2 ： ＰＴＨ−スタンダード（Ｘ）の交換手順

  1. 以下の組成でＰＴＨ−スタンダードを調製する。 
    ｐａｒｔ１  ：12.5μl	：−２０℃
ｐａｒｔ２  ：12.5μl	：−２０℃
ＰＥ−ｓｙｓ：12.5μl	：−２０℃
ＤＰＴＵ    ：12.5μl	：−２０℃
ＰＭＴＣ    ：   6μl	：−２０℃
Ｒ５   upto   ５ｍl	：４℃

    調製したＰＴＨ−スタンダードを取り付ける。
  2. （コントロールパネル操作）以下のキーを順番に押す。 
    ｍａｎｕａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ＞キー
ｆｕｎｃｔｉｏｎ＞キー
  3. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
    	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃５６
  4. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押す。
  5. ８の管の見えている部分の２／３まで来たら、ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。
  6. 次いで以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
    	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃６３
  7. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押す。
  8. ８の管に残っている液体が圧力で押し出される。
  9. ｃａｎｃｅｌ＞キーを押し、圧力を止める。

1.3：Ｒ３の交換手順

  1. Ｒ３（そのままでよい）を取り付ける。

    Ｒ３（トリフルオロ酢酸）：室温

  2. （コントロールパネル操作）以下のキーを順番に押す。 
    ｍａｎｕａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ＞キー
ｆｕｎｃｔｉｏｎ＞キー
  3. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
    	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃９
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃４０
  4. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押す。
  5. １５の管の見えている部分の２／３まで来たら、ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。
  6. 次いで以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
    	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃１８
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃４０
  7. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押す。
  8. １５の管に残っている液体が圧力で押し出される。
  9. ｃａｎｃｅｌ＞キーを押し、圧力を止める。

1.4：Ｒ４Ａの交換手順

  1. Ｒ４Ａ（そのままでよい）を取り付ける。

    Ｒ４Ａ（25% トリフルオロ酢酸／0.01% ＤＴＴ）：４℃

  2. （コントロールパネル操作）以下のキーを順番に押す。 
    ｍａｎｕａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ＞キー
ｆｕｎｃｔｉｏｎ＞キー
  3. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
    	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃５３
  4. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押す。
  5. ８の管の見えている部分の２／３まで来たら、ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。
  6. 次いで以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
    	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃６３
  7. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押す。
  8. ８の管に残っている液体が圧力で押し出される。
  9. ｃａｎｃｅｌ＞キーを押し、圧力を止める。

1.5：Ｒ１の交換手順

  1. Ｒ１（そのままでよい）を取り付ける。

    Ｒ１（5% フェニルイソシアネート(PITC)／n-ヘプタン）：−２０℃

  2. （コントロールパネル操作）以下のキーを順番に押す。 
    ｍａｎｕａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ＞キー
ｆｕｎｃｔｉｏｎ＞キー
  3. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
    	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃３
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃４０
  4. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押す。
  5. １５の管の見えている部分の２／３まで来たら、ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。
  6. 次いで以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
    	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃１８
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃４０
  7. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押す。
  8. １５の管に残っている液体が圧力で押し出される。
  9. ｃａｎｃｅｌ＞キーを押し、圧力を止める。

1.6：Ｒ２Ｂ、Ｓ２Ｂ、Ｓ４Ｂの交換手順

  1. Ｒ２、Ｓ２Ｂ、Ｓ４Ｂ（そのままでよい）を取り付ける。 
    Ｒ２（30% Ｎ−メチルピペリジン／55% メタノール／水）：４℃
Ｓ２Ｂ（酢酸エチル）                     ：室温・劇物
Ｓ４Ｂ（２０％ アセトニトリル／水）      ：室温・劇物

    ※ 注：Ｒ２は揮発しやすいので５００サイクルごとに交換する。

  2. （コントロールパネル操作）以下のキーを順番に押す。 
    ｍａｎｕａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ＞キー
ｆｕｎｃｔｉｏｎ＞キー
  3. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
    	−Ｒ２を交換するとき
	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４８
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃４０

	−Ｓ２Ｂ、Ｓ４Ｂを交換するとき
	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４９
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃４０
  4. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押す。
  5. ３０秒後ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。

1.7：シーケンサー作動時の試薬の交換手順

  1. 交換したい試薬が送液中でないことを確認する。
  2. ｍｏｒｅ＞キーを押し、ＲＵＮ ＭＯＮＩＴＯＲの２ページ目にする。
  3. ＣａｒｔｒｉｇｅとＦｌａｓｋが“ＷＡＩＴ”或いは“ＤＲＹ ＣＡＲＴ（ＤＲＹ ＦＬＡＳＫ）”のときを選んで以下のキーを順番に押す。 
    	ｐａｕｓｅ＞キー
	ｉｍｍｅｄｉａｔｅ＞キー
	ＭＡＩＮ ＭＥＮＵ＞キー
  4. 無くなった試薬を交換し、前記1.1〜1.6のうちから当てはまる試薬交換手順の操作を行う。
  5. 以下のキーを順番に押す。 
    ｒｕｎ ｍｏｎｉｔｏｒ＞キー
ｍｏｒｅ＞キー
＊ｐａｕｓｅ＞キー
ｒｅｓｕｍｅ＞キー
  6. シーケンサーが再び動作しているか確認する。

    ※ 注：シーケンサー作動時の交換を行うとクロマトグラムがおかしく出現するときがある。なるべく作動していない時に交換を行う。

２ 試薬・溶媒以外の交換手順

2.1：アルゴンガスボンベの交換手順

  1. ボンベ上部のメインサプライバルブを閉める。
  2. レギュレーターをボンベからはずす。
  3. アルゴンガスボンベを取り替える。
  4. レギュレーターを新しいガスボンベに取り付ける。
  5. メインバルブを開ける。
  6. ボンベの圧力を約5.0kg／cm２に設定する

2.2：重水素ランプの交換手順

ディテクターに装着された重水素ランプには寿命がある。通常ランプの寿命は約4ヶ月から10ヶ月くらい、保証期間は約2,000時間（電源つけっぱなしで約3ヶ月間）である。またランプの寿命は電源のＯＮ、ＯＦＦ時に大きく消耗するので2週間以上使用しないときを除いて電源はＯＮのままにしておく。

以下の状態になったときはランプの寿命である。ランプ切れの確認を行ないランプが切れていたときはランプの交換を行なう。

2.2.1：ランプ切れの確認手順

  1. 本体の右側面のパネルを外し、右側面の右下部にあるディテクターのパネルを上に開ける。
  2. 波長変更つまみを回し、波長を約５００ｎｍにセットする。
  3. フローセルの中をのぞく。このときランプが切れていたら真暗で何も見えない。ランプが生きていたら青緑色の光が見える。 
    ※ 注:波長が２６９ｎｍのとき決してのぞかないこと！
      （紫外線が出ているので目を傷めることがある）
  4. 光が見えなかったときはランプの交換を行なう。
  5. 波長変更つまみを回し、波長を２６９ｎｍにセットし直す。

2.2.2：ランプの交換手順

  1. 電源をＯＦＦにし、数分間待ってランプの熱を冷ます。
  2. （本体裏のパネルを外し）ディテクター後ろのＡＣパワーラインを外す。
  3. ランプハウジングケーブル（黒黒赤）を白いソケットからぬく。
  4. ランプを固定してるスプリングを緩める。（スプリングリテイニングクリップを奥に押しながら右に引くとスプリングが固定位置から外れる。）
  5. ランプ本体を手前に引くようにランプハウジングから外す。
  6. 新しいランプを上下の向きに注意して取り付ける。
  7. ３の操作とは逆にスプリングリテイニングクリップを引っ張りながら固定位置に取り付ける。
  8. ランプハウジングケーブルをソケットに差込み、ＡＣパワーラインをディテクターに差し込む。
  9. 電源をＯＮにする。
  10. 2.2.1のランプ切れ確認手順に従ってランプが点灯しているかを確認する。

2.3：カラムの交換手順

2.4：廃液

シーケンサーには３個の廃液ビンが取り付けられている。

シーケンサー右側：ＨＰＬＣ廃液
オープンドア内部：ＨＰＬＣ廃液
シーケンサー左側：シーケンサー廃液

それぞれ廃液ビンにたまってきたらシーケンサー廃液用のポリタンクに廃液を捨てる。

2.4.1：ＨＰＬＣ廃液

シーケンサー本体右側（３Ｌビン）とオープンドアを開けたインジェクター下部（４０ｍｌ）に廃液ビンが取り付けてある。これらは廃液ビンが満タンになったらシーケンサー廃液用のポリタンクに廃液を捨てる。

成分％
アセトニトリル３３％
水６３％
テトラヒドロフラン３％
酢酸ナトリウム１％未満
サンプルの一部１％未満

2.4.2：シーケンサー廃液

シーケンサー左側に本体に埋め込まれた透明なビンがシーケンサー廃液の廃液ビンである。

  • 廃液がボトルの上から約５ｃｍの位置まできたら必ず捨てる。
  • ボトル上部の黒いレバーを上に引き上げる。
  • ボトルを取り外し、シーケンサー廃液用のポリタンクに廃液を捨てる。（この廃液は強烈な異臭がするので注意）
  • ビンに約２ｃｍほど水（水道水でよい）を入れる。
  • ボトルの口にリングがはまり込むようにしっかりと固定する

    成分％
    酢酸エチル８１％
    ヘプタン１％
    水１２％
    アセトニトリル３％
    ＰＩＴＣ１％
    トリメチルアミン １％
    トリフルオロ酢酸１％

    2.5：コンバージョンフラスコの洗浄

    シーケンサーを長い間使用していると、コンバージョンフラスコの底部とピックアップチューブの先端部に白い沈殿物が見られるようになる。これはガラスフィルター由来の珪素が溜まるもので、ピックアップチューブを詰まらせる、等のインジェクショントラブルの一因となる。
    フラスコが白く濁ってきたら、以下の操作で洗浄を行う。

    ○準備するもの
	40mlの空ボトル                           : ２本
	２Ｎ水酸化カリウム(1.12g/10ml：KOH / 水) : 10ml
	蒸留水                                   : 20ml程度
    1. #Ｒ４Ａのボトルを緩める。（外さない）
    2. #（コントロールパネル操作）以下のキーを順番に押す。
      ｍａｎｕａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ＞キー
ｖａｌｖｅｓ＞キー
    3. #テンキーで１０を入力し、ｖａｌｖｅ ｏｎ>キーを入力する。
    4. #３０秒後、ａｌｌ　ｏｆｆ＞キーを押す。
    5. #テンキーで１３を入力し、ｖａｌｖｅ ｏｎ>キーを入力する。
    6. #３０秒後、ａｌｌ　ｏｆｆ＞キーを押す。
    7. Ｒ４Ａのボトルを外し、蓋を閉めて保存する。
    8. 40mlの空ボトルに蒸留水を入れＲ４Ａのボトルポジションに付ける。
    9. *Ｒ４Ａのボトルを外し、蓋を閉めて保存する。
    10. 40mlの空ボトルに蒸留水を入れＲ４Ａのボトルポジションに付ける。
    11. （コントロールパネル操作）以下のキーを順番に押す。 
      ＭＡＩＮ　ＭＡＮＵ＞キー
ｍａｎｕａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ＞キー
ｆｕｎｃｔｉｏｎ＞キー
    12. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
      	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃５３
    13. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押し、３０秒後８の管に蒸留水が流れたらｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。
    14. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
      	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃６３
    15. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押し、８の管の蒸留水が無くなったらｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。
    16. *以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
      	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃５２
    17. *ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押し、３０秒後ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。（フラスコ中に蒸留水を入れる）
    18. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
      	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃６１
    19. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押し、５秒後ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。（フラスコ中を攪拌する）
    20. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
      	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃６２
    21. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押し、３０秒後ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。（フラスコ中の蒸留水を捨てる）
    22. 14.* 〜 19.*までの操作をもう１回繰り返す。
    23. 1.# 〜 6.#までの操作を行う。
    24. 別の40ml空ボトルに10ml　２Ｎ水酸化カリウムを入れ、Ｒ４Ａのボトルポジションに取りつける。
    25. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
      	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃５２
    26. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押し、３０秒後ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。（フラスコ中に２N水酸化カリウムを入れる）
    27. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
      	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃６６
    28. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押し、２０秒後ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。（フラスコ中を攪拌する）
    29. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
      	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃６２
    30. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押し、５秒後ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。（フラスコ底部に届いているチューブへ２N水酸化カリウムを入れる）
    31. ３０分〜１時間（汚れがひどい場合には３、４時間）放置する。
    32. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
      	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃６１
    33. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押し、３０秒後ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。（フラスコ中を攪拌する）
    34. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
      	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃６２
    35. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押し、２０秒後ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。（フラスコ中の水酸化カリウムを捨てる）
    36. 1.# 〜 6.#までの操作を行う。
    37. 蒸留水を入れたのボトルをＲ４Ａのボトルポジションに付ける。
    38. 9.* 〜 19.*までの操作を３〜５回繰り返す。（フラスコ内を蒸留水で洗浄）
    39. 1.# 〜 6.#までの操作を行う。
    40. 保存しておいたＲ４Ａを取りつける。
    41. 9.* 〜 19.*までの操作を少なくとも２回繰り返す。
    42. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
      	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃５８
    43. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押し、１５秒後ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。（フラスコ中にＳ４Ｂを入れる）
    44. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
      	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃６１
    45. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押し、５秒後ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。（フラスコ中を攪拌する）
    46. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
      	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃４０
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃６２
    47. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押し、２０秒後ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。（フラスコ中のＳ４Ｂを捨てる。）

    ３ サンプル解析

    3.1：リアクションカートリッジ組み立て

    1. カートリッジキャップを半時計周りに回してはずす。
    2. Springワッシャー、Keyedワッシャーをはずす。
    3. Upper Glass カートリッジブロック内のサンプル（切り取ったＰＶＤＦ膜）とろ紙をピンセットで取り除き、ろ紙を交換する。
    4. 新たなサンプルをUpper Glass カートリッジブロック内に入れる。
    5. サンプルを落とさないようにをろ紙の上にのせUpper Glass カートリッジブロック、Springワッシャー、Keyedワッシャーをのせる。
    6. カートリッジキャップを時計周りに回してカートリッジをもとに戻す。この時、 静かに回さないとワッシャーがずれ最後まで締まらないので注意。

    3.2：カートリッジリークテスト（漏れチェック）

    解析中不純物がカートリッジ内に混入しないようにするため、カートリッジを組み立てる度にリークテストを行なう。

    1. （コントロールパネル操作）以下のキーを順番に入力する。 
      	ｍａｎｕａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ＞キー
	ｖａｌｖｅｓ＞キー
    2. テンキーで２０を入力し、ｖａｌｖｅ ｏｎ>キーを入力する。
    3. ４７６Ａ前面のパネルを開き、Ｂレギュレータのつまみを回し、圧力を4.5psiにセットし３０秒間放置。
    4. Ｂレギュレータのつまみを半時計周りに圧力指示針が止まるまで回す。このとき約4.0psiで圧力指示針が止まるが、止まらずに０まで下がる場合はカートリッジの組み立てが上手く出来てない（ワッシャー、ろ紙等を忘れている）、もしくはバルブからの漏れが考えられる。対処法については後述。
    5. ５分後に再度指示圧を読み、４で図った圧力からの減りが0.1psi以下であることを確認する。

      −４で計った圧力からの減りが0.1psi以上の場合は ａｌｌ ｏｆｆ＞を押してカートリッジを組み立てからやり直す。<-P>

    6. 以下のキーを順番に入力する。 
      ａｌｌ ｏｆｆ＞キー
ＭＡＩＮ ＭＥＮＵ＞キー
ｍａｎｕａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ＞キー
ｆｕｎｃｔｉｏｎ＞キー
    7. 以下のパラメータを設定する。（赤い文字が入力する数値） 
      	Ｃａｒｔｒｉｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ： ＃１７
	Ｆｌａｓｋ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：       ＃４０
    8. ｅｘｅｃｕｔｅ＞キーを押し、Ｂレギュレータの圧力を2.5psiにセットする
    9. ｃａｎｃｅｌ＞キーを押す。

    3.3：シーケンス開始

    リークテストが終わったら、シーケンスを開始する。

    1. （パソコン・Ｍacでの操作） 
      @まず６１０Ａ解析プログラムを起動させる。
A｢Acquisition｣をクリック。
B｢start collecting from 476A...｣を選択する。
Cウインドウが出てきたらファイル名を記入し｢save｣をクリック。
D次のウインドウが出てきたらＯＫをクリック。
E解析画面がでたら、以下の操作を行なう。
    2. （コントロールパネル操作）以下のキーを順番に入力する。 
      ＭＡＩＮ ＭＥＮＵ＞キー
ｅｄｉｔｏｒｓ＞キー
ｅｄｉｔ ｒｕｎ＞キー
    3. 以下の設定を入力する。（赤い文字が入力する数値） 
      −スタンダードのみ見たいとき（リークテスト不要）
        −ＥＤＩＴ ＲＵＮ ＦＩＬＥ ＃５−      ｅｄｉｔ ｍａｉｎ＞
ＨＥＡＴＥＲＳ｝   Ｃａｒｔｒｉｇｅ：５３℃   Ｆｌａｓｋ：６４℃
ＢＬＯＣＫ＃１     Ｃｙｃｌｅ：“ＦＳＴＢＬＴ”Ｇｒａｄｉｅｎｔ：１
                     ＃Ｒｅｐｓ：ｘ１［１ ｃｙｃｌｅｓ：１−１］

−新しいサンプルで解析を行なう時
        −ＥＤＩＴ ＲＵＮ ＦＩＬＥ ＃４−      ｅｄｉｔ ｍａｉｎ＞
ＨＥＡＴＥＲＳ｝   Ｃａｒｔｒｉｇｅ：５３℃   Ｆｌａｓｋ：６４℃
ＢＬＯＣＫ＃２     Ｃｙｃｌｅ：“ＦＳＴＢＬＴ”Ｇｒａｄｉｅｎｔ：１
                     ＃Ｒｅｐｓ：ｘ○○［１ ｃｙｃｌｅｓ：１−○○］

−カートリッジ内のサンプルで引き続き解析を行なうとき
        −ＥＤＩＴ ＲＵＮ ＦＩＬＥ ＃６−      ｅｄｉｔ ｍａｉｎ＞
ＨＥＡＴＥＲＳ｝   Ｃａｒｔｒｉｇｅ：５３℃   Ｆｌａｓｋ：６４℃
ＢＬＯＣＫ＃２     Ｃｙｃｌｅ：“ＦＳＴＢＬＴ”Ｇｒａｄｉｅｎｔ：１
                     ＃Ｒｅｐｓ：ｘ○○［１ ｃｙｃｌｅｓ：１−○○］

※○○の部分にはサイクル数を入力する。
    4. 以下のキーを順番に入力する。 
      ＭＡＩＮ ＭＥＮＵ＞キー
ｓｔａｒｔ ｒｕｎ＞キー
    5. ・ＲＵＮ ＦＩＬＥ ＃  に４、又は５、又は６
・Ｂレギュレーターの圧力指示針が2.5spi
・ 試薬、廃液ビンの量
・ パージバルブが締まっているか
を確認する。
    6. ＳＴＡＲＴ＞キー、ＹＥＳ＞キーを押す。

    3.4：シーケンス中断

    シーケンシングの途中で中断したいとき、サイクルの終わりで中断できる。

    1. 以下のキーを順番に押す。 
      ｍｏｒｅ＞キー
ｐａｕｓｅ＞キー
ｐｒｅｓｅｔ＞キー

※ 注：ｐａｕｓｅキーを押した時の他のキーの説明。
ｉｍｍｅｄｉａｔｅ＞：即座にサイクルランニングを止める。但し
                      ＨＰＬＣは動く。
ｒｅｓｕｍｅ＞      ：ポーズ後、続きを始める。
    2. ＣＹＣＬＥ＃＿に分析をとめるサイクル数を入力する。（このサイクル数は残りサイクル数ではないので注意！）
    3. ｅｎｔｏｒ＞キーを押す。

      ランモニター１ページ目ｓｔｏｐ ｒｕｎ＞キーを押すと強制終了させることが出来ます。このキーを押した後ｙｅｓ＞キーを押すと強制終了し、ｎｏ＞キーを押すとＨＰＬＣは動き続ける。

    ４ トラブルシューティング

    4.1：クロマトグラムが直線になったとき

    1. パージバルブが締まっていない。

      パージバルブが締まっていないと、クロマトグラムが直線になって現れる。特にＨＰＬＣ溶液を交換した際にはパージバルブがよく締まっているかどうか確認する。（パージバルブはどちらの方向に回してもそのうち回らなくなるので、バルブが閉じるようにまわす。）

    2. Ｂレギュレーターの圧力指示針が０になっている。

      通常解析するときのＢレギュレーターの圧力指示圧は2.5psiである。リークテスト時には圧力を変更しているので、リークテスト終了後、Ｂレギュレータの指示圧を3.2の動作手順どうり圧力をもとに戻したかどうか確認する。
      それを行ってもＢレギュレータの指示圧がもと０のままのときは、シーケンサーのバルブ（特に８と２０）のフェラルが緩くなっている可能性がある。バルブをよく閉め、それでも０のままなら、電話してみる。

    3. 重水素ランプが切れている。

      重水素ランプの寿命は通常４ヶ月から10ヶ月（保証期間は２０００時間）である。2.2の動作手順に従い、ランプが切れたかどうか確認し、切れていたらランプの交換を行う。

    4.2：ピークの分離が悪いとき

    1. Ａ、Ｈの分離が悪いとき。

      長い間使用しているとＡとＨのピークが重なってくることがある。このとき、ＨＰＬＣ溶液Ａ３の２lビンにPremix Bufferを加える。加える量は２lビンで普段の40mlから、50ml入れるようにする。途中まで使用した時は減った分を考慮して入れる。

    2. サンプルの質が低下している。

      サンプルは長い間放置しておくと変質し、シーケンサーで測定できないことがある。サンプル（ＰＶＤＦ膜）は常に冷凍庫の中で保存する。サンプルの質が低下したら、新たなサンプルを作成（新たにブロッティングを行う）する。

    3. 試薬Ｒ２Ｂを５００サイクル以上使用した。

      476Aシーケンサーでは試薬Ｒ２Ｂから出る気体を利用しエドマン分解を行っている。よってＲ２Ｂは他とは異なり使用する度にＲ２Ｂの気体が徐々に無くなる（このときピークのシグナルが弱くなる）。このときＲ２の液体（水／メタノール）は無くならないで残る。Ｒ２Ｂは、使用したサイクル数を記録し５００サイクル以上使用したら交換するようにする。

    4. その他（Ｒ２Ｂ以外）の試薬を長い間交換していない。

      Ｒ２Ｂ以外でも長い間シーケンサーに取り付けたまま放置しておくと試薬が劣化してしまうことがある。長い間使用しないでピークの分離・シグナルが弱くなったときは他の試薬も交換する（特に冷蔵・冷凍保存するもの、溶液Ａ３、Standard等）。

    5. フリーランを長い間行っていない。

      カラム内に老廃物が溜まるとピークの分離が悪くなることがある。そこでフリーランを何度か行いカラム内の老廃物を流し出す。フリーランの行い方は1.1の７）以降の項目を参照すること。

    6. カラムの交換時期がきている。

      前記１）〜５）までのどれにもあたらない場合、カラムの交換時期が来ている可能性がある。2.3のカラムの交換手順に従い、カラムの交換を行う。

    4.3：リークテスト中、Ｂレギュレーターの圧力指示針が0になる

    1. リアクションカートリッジの組み立てが悪い。

      リアクションカートリッジの組み立てでゆるく取り付けたりすると、そこから気体が漏れるので指示圧が下がる。きちんとリアクションカートリッジが締まっているかどうか確認を行う。
      また、ワッシャーや、カートリッジシールが無い場合も気体が漏れるので指示圧が下がる。全ての部品をきちんと取り付けたかどうか確認する。

    2. アルゴンガスの残量が無い。

      アルゴンガスの残量が無くなると指示圧が下がる。ボンベに取り付けてあるレギュレータの右側のメーターを見てアルゴンガスの残量を確認する。

    3. バルブの取り付けがゆるくなっている。

      リアクションカートリッジに試薬を供給しているバルブ８とバルブ２０の取り付けが緩くなったり壊れたりすると、そこから気体が漏れ出し指示圧が下がる。バルブ８とバルブ２０のネジを半回転ほど締め、それでも指示圧が下がる時はバルブを取り外してもう一度取付けを行う。

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